标准类别： NY-行业标准（农业）
关键词： 增产菌筛选方法
标准号： NY 336—1998
标准名称： 增产菌筛选方法*
标准分类： 农业土壤化肥标准
颁布部门：
颁布日期：
实施日期：

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1 范围
本标准规定了芽孢杆菌（Bacillussp ）增产菌的筛选技术指标、筛选方法。
本标准适用于芽孢杆菌增产菌新菌株的筛选。
2 引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
HG/T3309—1993 农药粉剂细度测定方法（原 HG/T2-896—83）
NY337—1998 增产菌使用方法
3 总则
增产菌属芽孢杆菌是依据植物微生态学原理研制出的一种微生态制剂。增产菌采用了从植物体内分离内生共生芽孢杆菌菌株的筛选方法，经过菌株纯化、生物测定、菌株鉴定、复壮促活，筛选出的菌株通过两年两点田间试验和多点试验，选择能够稳定提高植物产量、改进品质、增强抗逆性，并且经安全性测定，对人、畜及植物无毒、无害，对环境无污染的菌株，供生产使用。
4 主要方法提要与技术指标
4 1 方法提要
4 1 1 收集样本植株或各部位的组织冲洗24h，严格进行表面消毒，然后捣碎制成悬浮液，沉淀。
4 1 2 取上清液经划线或稀释后在牛肉汁平板培养基上培养24h。
4 1 3 选取有代表性的单菌落进行涂片、染色和镜检，选取芽孢杆菌的单菌落移到斜面培养基上编号、培养，进行生物测定。
4 1 4 分别进行室内生物测定，选择生物测定较佳纯菌株再进行田间试验。
4 1 5 选择通过两年田间试验或多点试验表现增产、防病等效果好的菌株，并经安全性检查对人、畜及植物无毒，对环境无污染的菌株，才可提供生产使用。
4 2 技术指标
4 2 1 采集的样本植株要在80 水浴锅内加热处理 10! 20min，以杀死杂菌。
4 2 2 分离得到的芽孢杆菌菌株，应在 28! 35 温度下培养 18! 24h，此为芽孢杆菌最适宜生长的环境。
4 2 3 将待生物测定的作物，包括种子、植株或块（根）茎，置于含芽孢杆菌浓度有 108悬
浮液中浸泡 1h。
5 筛选方法
5 1 样本的采集
5 1 1 直接采样方法
取样时应注意以下三点：
a）样本植株应与所选的增产菌施用作物相一致；
b）要选择在产量、品质或各种抗逆性方面比同类植株有明显优势的植株；
c）选好样品植株后，进行编号、登记，立即分离或置于 4 条件下保存。
5 1 2 间接采样方法
如采取样本植株有困难，可选采集不同地区的土壤，在室内种植作物，按 5 1 1规定的原则采集样本植株。
5 2 菌种分离
5 2 1 仪器设备和试剂
仪器设备：无菌操作室或超净工作台、灭菌锅、水浴箱、冰箱、温箱、灭菌研钵和研棒、灭菌管（5mL、10mL）、磁力振荡器、灭菌平皿、灭菌试管、无菌水、酒精灯、接种环、显微镜、
玻片、灭菌玻璃球。
试剂：pH试纸、氢氧化钠、盐酸、漂白粉、品红、孔雀绿和香柏油等。
5 2 2 培养基制备
5 2 2 1 试剂
牛肉膏（生化试剂）、蛋白胨（生化试验）、琼脂（生化试剂）。
5 2 2 2 培养基材料
牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，氯化钠，琼脂 20! 30g，蒸馏水 1000mL。
5 2 2 3 培养基制法
将琼脂加热化开，加牛肉汁和蛋白胨，再加热溶解，用 0 11mol/L的盐酸或 0 1mol/L氢氧化钠溶液调 pH值至 7 0! 7 5，分装三角瓶或试管置灭菌锅内，在 0 1MPa压力下灭菌 30min，冷却后制成斜面培养基备用。
5 2 3 分离培养
5 2 3 1 分离
取 5 1 1和 5 1 2的样本植株的根、茎、叶、花和果实、种子或块茎（根）组织冲洗 24h，
严格进行表面消毒，然后取组织 10g剪碎，放入装有 40mL无菌水和 10粒无菌玻璃球的三
角瓶中，在 200! 300转振荡 10min（如分离表皮以内的细菌，则先经 0 5%的漂白粉液表面消毒 3! 5min，用无菌研钵研碎后，再振荡，静置 0 5min，用灭菌吸管取 5mL上清液注入灭菌试管内备用）。
5 2 3 2 培养
将 5 2 3 1处理的盛有上清液的试管置于 80 的水浴锅内恒温处理 20min。然后用灭菌移种环蘸取试管内处理液，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线。划线方法：先在培养皿平板的半边顺序划线，再将培养皿转 90 ，将移种环灭菌后从第二条线处开始顺序划线（或用 L型或8型无菌涂棒，将菌液均匀地涂布在平板表面，必要时采用稀释平板法或单菌落），置 28! 35 下培养 24h后再观察。
5 2 3 3 菌落挑选
根据细菌在平板培养基上形成菌落的形态，如菌落大小、形状、圆或不规则形，边缘毛状，菌苔厚或薄，起皱、光滑或粗糙，色泽透明或暗等不同特征，挑选不同类型单菌落（如菌
落不纯应进行纯化），分别进行涂片、染色和镜检。
5 2 3 4 涂片
用灭菌接种环在选定的菌落边缘上蘸取少许菌体，置盛有 10mL无菌水的试管内振荡，制成细菌悬浮液；再用无菌微吸管或无菌接种环蘸取悬浮液 1! 3滴，加在洁净玻片上，并用无菌接种环将菌液滴均匀涂匀，使菌液干燥后即可染色、观察。
5 2 3 5 染色
通常用革兰氏染色法对细菌染色，将菌体染成红色或紫色，芽孢不着色。用以下特殊染色法将菌体和芽孢染成不同颜色（菌体红色，芽孢绿色），便于观察。
试剂：染色剂 I为 5%孔雀绿水溶液，染色剂$为 0 5%藏红水溶液或 0 5%碱品红水溶液。
染色步骤：于干燥的涂片上加染色剂#，在酒精灯上加热 1min（注意勿使染色液沸腾和干燥），用水洗去多余的染液，再加染色剂$染 15s，然后用水洗去染液，用吸水纸吸干后置显微镜下观察。
5 2 3 6 镜检
在油浸镜下进行观察，将涂片标本放在显微镜的载物台上，将高倍镜对准后，再加一滴香柏油浸镜头观察。操作时注意：在玻片上加油滴后，用显微镜的自动止降装置将油浸镜头下移到油滴中，到停止下降为止。然后用微调钮上调对准焦点，进行观察。使用完后，用擦镜纸将镜头和镜台上多余油擦去，再用脱纸棉团蘸取少许二甲苯轻擦镜头油污，立即用擦镜纸将二甲苯擦去。通过镜检，凡芽孢染成绿色，菌体染成红色的则可确定为芽孢杆菌。将芽孢杆菌的菌落编号，并转移到斜面培养基上，置 28! 35 的温箱中培养24h，取出放在冰箱保，待生物测定。
5 3 室内生物测定
5 3 1 仪器设备
花盆（上口径 18cm，高 20cm）、托盘天平、血球计数器、显微镜、振荡器、试管、三角瓶、冰箱、温箱。
5 3 2 土壤
腐植土 2份，砂土 1份，草炭 1份，混匀装入小花盆内备用。
5 3 3 菌悬液制备
将 5 2 3 6编号保存待测的菌株，转移到斜面上，在 28! 35 条件下培养 24h后取出，刮取菌苔于无菌水试管或三角瓶中，在振荡器上振荡 2min，充分混匀制成芽孢菌量为108个 /mL的菌液（用血球计数器在显微镜下计数）。
5 3 4 供试验作物播种
作物种子应整齐饱满，发芽率不低于 95%，种子经催芽露白后，选发芽长势一致的种子，在待测菌悬浮液（5 3 3）108个 /mL中浸泡 1h，晾干种子表面水分，然后播于 5 3 2的花盆中，每盆播种 10粒，每个菌株播种不少于 10盆。
5 3 5 生物测定作物管理
将 5 3 4处理的盆栽植株定期浇水，统一管理，尽量使各处理的生长环境（如采光、温度和湿度等）均匀一致。
5 3 6 生物测定作物调查项目
作物生长 30天后，调查幼苗总鲜重、根鲜重和地上部鲜重。每个菌株重复生测 3! 5次，选出生测效果显著而稳定的菌株进行田间试验。
5 4 田间生物测定（田间试验）
5 4 1 试验地点的选择
针对某种作物，在两个不同生态区选择同种作物，进行两年两点的田间试验，明确供试验菌株增产性能的平均表现，增产效果稳定性及区域的适应性。试验地块要平坦，肥力要均匀一致。
5 4 2 试验小区的布置
每一菌株为一处理，以清水为对照，小区随机区组排列或成对区组排列，每一处理至少重复 3次，小区面积不小于 60m2，以 0 0133ha为宜，要设保护行和隔离带。
5 4 3 菌剂制备
将室内生物测定所得到的菌株经发酵生产制成粉状菌剂，供田间试验用。
5 4 4 处理方式
5 4 4 1 拌种
将干种子喷水或浸湿，然后以 75! 150g/ha的菌剂撤入种子中（见 NY337），翻动数
次，使菌剂均匀地附在种子表面，晾干种子表面的水分，即可播种（每公顷用种量超过 150
kg者，应增加相应的菌量）。
5 4 4 2 喷雾
将菌剂以 75! 150g/ha的菌量，加适量的水稀释配制成悬浮液（见 NY337），充分搅拌
即可喷雾。
5 4 4 3 浸蘸根（秧）苗
按 75! 150g/ha的菌量加适量的水稀释（见 NY337），进行浸蘸根（秧）苗，使菌液均匀
地沾附在根（秧）苗上，稍晾干即可栽植扦插。
5 4 5 田间管理
a）各小区的水肥管理要一致；
b）喷雾时应避免不同菌株间的相互感染，灌溉时严禁小区间串水；
c）尽量减少鸟、兽、虫、病的危害。
5 4 6 调查记载
5 4 6 1 记载项目
记载项目因作物种类不同，筛选的目标不同，其记载内容和要求指标也不同。以提高某种作物产量为目标时，则应对影响产量的性状进行重点观察记载；以提高某种作物抗病性为目标时，应对该作物的某种主要病害和防治程度进行观察记载；以改进某种作物品质为目标时，则应对其影响品质的指标进行调查记载。对同一种农作物，有同一种筛选目标时，所有观察记载项目都要相同，才有可比性。可参照作物考种方法进行设计。
5 4 6 2 抽样单位及抽样方法
对于株型高大且株距、行距确定的作物（如玉米、高粱）和穴植作物（如马铃薯、甜菜），
以株或穴为基本抽样单位；对条播和撒播作物（如小麦），以 1m2面积或 1m长双行为基本取样单位。取样要严格定点、定株或严格随机取样，避免出现人为误差。
5 4 7 产量测定
要求试验小区进行全田产量测定。
5 4 8 数据整理和结果分析
将所得结果按不同区组处理，以表格形式汇总，然后进行方差分析，比较各处理差异的显著性，并找出效果最佳的菌株。如有多点联合试验资料还可以明确各菌株效果的稳定性及其所适应的生态区域。
5 4 8 1 成对数据整理的统计分析
按式（1）计算一对数据之间差异数平均数 d：
d=X1-X2 ……………………………………（1）
式中：X1———处理平均数；
X2———对照平均数。
按式（2）计算成对数据差异数平均数6d：
6d=*d
Y ………………………………………（2）
式中：* d———数的总和；
Y———重复数。
按式（3）计算差异数平均数的标准差 Sd：
Sd=* d2-（* d）
Y-（ Y-1）…………………………………（3）
式中：* d2———和平方差异数平均数；
* d———数的总和；
（ Y-1）———自由度，并查 t值表确定差异的显著水平。
按式（4）计算显著水平 t值：
t=d
Sd ………………………………………（4）
式中：d———差异数；
Sd———差异数平均数标准差。
5 4 8 2 随机区组试验的统计、分析
一般多采用方差分析法（LSR）进行统计分析。
5 5 安全性考察
5 5 1 菌剂制备
通过生物测定确定的菌株用发酵法制成粉剂或液剂备用。
5 5 2 安全试验
将 5 5 1菌剂参照卫生防疫标准进行部分安全性试验，对人、畜安全的，则可提供生产使用。
5 6 菌株确定
通过 5 4 8和 5 5 2试验，凡在作物产量、品质或各种抗逆性状上均有明显优势的菌株即可确定为生产上推广应用的新菌株。