标准类别： NY-行业标准（农业）
关键词： 增产菌生产工艺流程
标准号： NY 335—1998
标准名称： 增产菌生产工艺流程*
标准分类： 农业土壤化肥标准
颁布部门：
颁布日期：
实施日期：

========================================================

1 范围
本标准规定了增产菌芽孢杆菌（Bacillussp ）的生产工艺流程、技术要求和操作规程。
本标准适用于以芽孢杆菌为菌种，经液体深层发酵法生产增产菌粉剂产品的发酵工艺。
2 引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
HG/T3309—1983 农药粉剂细度测定方法（原 HG/T2—896—83）
NY334—1998 增产菌粉剂
3 总则
增产菌属芽孢杆菌是依据植物微生态学原理研制出的一种微生态制剂。
增产菌生产工艺流程选用芽孢杆菌为菌种，经液体深层发酵法制成粉剂。主要环节原菌种活化3菌种扩大培养3种子罐培养3发酵罐培养3添加填充料3压滤3干燥3粉碎3粉剂质量检测3包装3产品检测。
4 技术要求
技术要求见表 1。
表 1
步骤 项目名称 技术指标
温度 121! 125
实消压力 0 11MPa
1 灭菌要求 压力 空消压力 0 11MPa
时间 30min
温度 28! 30
压力 0 05MPa
2 培养条件 通气量 1 1
（每分钟进出空气体积比）
pH值 7 0! 7 5
含菌量 #30亿个 /g
3 放罐指标 芽孢形成量 #70%
杂菌量 $0 3%
含菌量 300亿个 /g
含水量 $5%
4 成品标准 细度 0 95mm孔径筛
杂菌量 $1%
5 生产工艺流程
原菌种活化3菌种扩大培养3发酵罐培养3加填充料3压滤3干燥3粉碎3成品检验3包装
6 菌种生产操作规程
6 1 仪器设备和试剂
无菌室或超净工作台、灭菌锅、试管、克氏瓶、冰箱、温箱、显微镜、氢氧化钠、盐酸、氯
化钠、牛肉膏、蛋白胨和琼脂等。
6 2 培养基制备
按如下配方制备培养基：牛肉膏 0 3%，蛋白胨 1%，氯化钠 0 5%，琼脂 2%。将琼脂加热溶化后用 0 1mol/L氢氧化钠或 0 1mol/L盐酸调 pH值 7 0! 7 5，然后分装克氏瓶或试管，置于灭菌锅内，在 0 11MPa压力下灭菌 30min，冷却后制成斜面备用。
6 3 菌种活化与扩大培养
用培养基在无菌条件下从原菌种斜面上挑取少许菌苔，置放试管斜面内进行划线，然后置 28! 30 温箱内培养 24h，经检查无杂菌，菌体生长整齐，再置于 28! 30 温箱内培养 24! 28h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片、染色检查无杂菌，芽孢大小一致的，可放冰箱中存放备用（4 左右为宜）。涂片、染色方法按 7 2 8 3规定进行。
7 发酵生产操作规程
7 1 仪器设备和试剂
种子罐、发酵罐、水浴锅、显微镜、载玻片、克氏瓶、三角瓶、试管、吸管、血球计数板、氢
氧化钠、盐酸、氯化钠、pH试纸、酒精、品红、孔雀绿等。
7 2 种子罐培养
7 2 1 培养基
种子罐培养基所用碳原主要有葡萄糖、玉米浆、淀粉、糊精、植物油（兼消泡剂）；氮原主要有花生饼粉、豆饼粉、鱼粉、无机盐及微量元素。一般发酵参考如下配方装料：花生饼
粉 0 5%，鱼粉 0 3%，玉米浆 0 5%，葡萄糖 0 3%，豆油 0 2% ! 0 3%（或泡敌 0 3%）。
7 2 2 空发酵罐灭菌
发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在 0 11MPa压力下灭菌 30min。
7 2 3 种子罐装料
参考 7 2 1的配方比例装料，投料量不得超过罐容积的 70%。
7 2 4 发酵罐灭菌
装好料后，在 0 11MPa压力下灭菌 30min，冷却至 30 后即可接种。
7 2 5 种子罐接种
7 2 5 1 悬浮液制备
在无菌条件下将每个克氏瓶斜面菌种加 100mL无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为 10亿个菌体 /mL，并在 80 恒温水锅中处理 20min。
7 2 5 2 接种
将制好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按 1%的比例接种于冷却至 30 的种子罐内进行培养。
7 2 6 种子罐培养条件的控制
接种后在温度为 28! 30 ，压力 0 05MPa，通气量 1 1（每分钟进出空气体积比）和220r/min搅拌条件下，培养 8! 10h。
7 2 7 发酵罐培养过程中的检测
接种后 4h开始，每隔 2h取样一次检测，包括菌体生长状况、含菌量和 pH值，达到如下指标，即可移种至发酵罐内发酵培养。
a）菌体生长整齐；
b）处于对数生长期；
c）含菌量 2亿个 /mL以上；
d）无杂菌污染。
7 2 8 检测方法
7 2 8 1 取样
在无菌条件下，取培养液 50! 100mL，于灭菌三角瓶中，检测备用。
7 2 8 2 pH值的调节
用 pH试纸（适用范围 pH值 4! 8）进行比色，用滴管将一滴发酵液滴到 pH试纸上，观察试纸上指示剂颜色变化，用比色卡进行比色来确定发酵液的 pH值，并用 1mol/L的氢氧化钠或盐酸调节发酵液的 pH值，使发酵液 pH值保持在 7 0! 7 5左右。
7 2 8 3 菌体生长状况
用涂片、染色法观察菌体生长状况。用无菌吸管或接种环取发酵液一滴或 2! 3滴，置于洁净载玻片上，用移种环在玻片上均匀涂抹，干燥后用孔雀绿、藏红染色法将菌体和芽孢染成不同颜色，在显微镜下观察。
7 2 8 4 染色步骤
孔雀绿 0 5%的水溶液染色剂 I或碱性品红配制成 0 05%的水溶液染色剂$。在固定好的涂片上加染色剂#，置酒精灯火焰上微加热染色 1min，勿使染色液沸腾和干燥，用水洗去染色液后，加染色剂$染色 15min，再用水洗去染色液，用吸水纸吸干即可在显微镜下观察，注意此时菌体染成微红色，芽孢染成绿色。
7 2 8 5 含菌（孢）量检测
用血球计数法观察菌体孢体的数量，将发酵液用无菌水稀释至 108! 1010倍备用（至适宜的倍数为准）。再将洁净盖玻片放在血球计数板上有刻度的位置上，从盖玻片的一侧加小滴稀释的发酵液（使每小格只有 5! 10孢子为宜）。再在显微镜下观察每个小格的芽孢菌数目，每视野观察 80个小格，以平均数乘以 106，再乘以稀释倍数，即为发酵液的含菌数。每次计数测定应不少于五个视野数（即不少于 5 80个小格的平均数）。其含菌量
n1按式（1）计算：
n1=D C
80 4 106 ………………………………（1）
式中：C———稀释倍数；
D———80个小格的芽孢总数；
4 106———血球计数板每小格容积换算成 1mL容积的常数。
7 3 发酵罐发酵生产
7 3 1 发酵罐空消
发酵罐在接种前要经过严格灭菌处理，洗净后在 0 11MPa压力下灭菌 30min。
7 3 2 发酵罐投料
配方：花生饼粉 2%，鱼粉 0 3%，玉米浆 1 8%，糊精 0 5%，硫酸镁 0 075%，碳酸钙
0 5%，磷酸二氢钾 0 04%，豆油 0 1%或泡敌 0 05%，用 1mol/L氢氧化钠或 1mol/L盐酸
调 pH值 7 0! 7 5左右，投料量不得超过罐容积的 70%。
7 3 3 发酵罐培养
发酵培养条件：搅拌速度 180! 200r/min，罐压 0，05MPa，移种后 4h内通气量为 1 0 7
! 0 8（每 min体积之比），以后逐渐增大至 1 1。一般发酵培养周期为 18! 24h，在芽孢大量形成，个别芽孢开始脱落时，符合 7 3 5放罐指标，即可放罐。
7 3 4 发酵过程中的检测内容及检测方法
投料后 4h开始，每隔 2h取样检测一次，至 18h后，取样间隔缩短为 0 5! 1h。达到如下指标即可放罐。
a）芽孢含量#70%；
b）杂菌污染$0 3%；
c）含菌量#30亿个 /mL。
7 3 5 检测指标与检测方法同7 2 7和 7 2 8。
8 后处理操作规程
8 1 仪器设备
搅拌机、板框、干燥机（装置）、超细度粉碎机等。
8 2 吸附剂
一般采用的粒度为 0 09mm孔径筛的轻质碳酸钙为吸附填加剂，加入量按式（2）计算：
吸附剂的量 =发酵液体积 发酵液含菌量
300亿个 /g +50% ! 80%固体投料量 ……（2）
8 3 压滤
按 8 2规定加入吸附剂后，机械搅拌 3! 6h，使菌孢全部被吸附，然后再用板框压滤。
8 4 干燥
将板框压滤后的滤饼捣碎后，置于烘干机或烘干装置内进行烘干。烘干时的温度不超过 70 ，要不断翻动，使受热均匀。当含水率$5%时，即可进行粉碎、包装。
8 5 粉碎
利用高细度粉碎机粉碎，100%通过 0 09mm孔径筛。
9 成品检验
按 NY334执行。含水率用干燥失重法（重量法）测定，含水率$5%为合格，细度采用湿筛法测定，100%通过 0 09mm孔径筛为合格，具体方法按 HG/T3309—1983中湿筛法测定。
10 包装
按 NY334执行。用聚乙烯袋 20g包装，每 50袋装一大袋，每箱 10大袋，净重 10kg，于干燥通风处贮存，保存期 3年。